Готовят срезы из различных отделов головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечек, продолговатый мозг). Для приготовления срезов извлеченные кусочки мозгового вещества предварительно фиксируют в одной из следующих жидкостей: в ацетоне, 10% - ном водном или спиртовом растворе 40% - ного нейтрального формалина, смеси Дюбокс –Брарель – Буэна и смеси Адуцкевича. Общие требования при фиксации следующие: объем фиксирующей жидкости должен превышать объем материалов не менее, чем в 10 раз; кусочки материала располагать свободно, чтобы не соприкасались друг с другом и со стенками сосуда, для чего на дно его помещают слой ваты. В различной фиксирующей жидкости материал выдерживается определенное время [8].

Перед пропитыванием парафином материал обезвоживают. Пропитывание парафином проводят вначале при 37 С, затем при 56 С. По окончании этого процесса выризают кусочки материала с окружающим слоем парафина (блоки) , из которых при помощи микротом делают срезы нетолще 5 микрон. Парафиновые блоки можно хранить длительное время. При переносе в новую обрабатывающую среду кусочки рекомендуются подсушивать фильтровальной бумагой. После соответствующей обработке срезы наклеивают на предметное стекло и накрывают порковным стеклом.[8]

По окраске срезов существуют следующие способы : по Адуцкевичу, метод Турбиной, по Туревичу, по Ленцу.

Если не возможно приготовить срезы, делают мазки-отпечатки. Их окрашивают по Муромцеву (результат окраски: фон препарата серо-голубой, ядра нервных клеток – синие, тельца Бабеше – Негри – бледно – фиолетовые с темными включениями) ; по Борману – Гайнуллиной ( результат окраски: основной фон – ярко – красный, протоплазма нервных клеток – красновато – синяя, а их ядра – темно – синие; тельца Бабеша – Негри – земляничнно - красноватого цвета степично гранулярной структуры, эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков) ; по Михину; по Селлерсу.

При отсутсвии телец Бабеше – Негри при микроскопическом исследовании мозга бешенство не исключают. Для выявления антигена используют реакцию диффузной преципитации (РДП) и прямой иммунофлюоресценции (ИФ), а также выделение вируса бешенства методом биопробы [16].

ИФ. Один из основных тестов при диагностике бешенства. При высококвалифицированном выполнении получают в 99 -100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюорисцирующего Ig. Метод ИФ дает возможность обнаружить вирус бешенства в клетках роговицы глаз и предварительно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического ее проявления. Метод может быть использован для исследования подозреваемых в заболевании бешенства животных, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все правила личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Окрашивают препараты по общепринятой методике.

РДП. Применяют для обнаружения антигена вируса бешенства в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП проста по выполнению и специфична, но прцент выявления вирусного антигена в исследуемом материале составляет 45-70% [22].

При отрицательном РДП тоже нельзя исключать бешенство. В таких случаях используют метод флюорисцирующих антител (МФА). При положительном результате в мазках – отпечатках из свежего мозга или отпечатках с роговицы, обработанных антирабической сывороткой, меченной флюоресцирующим красителем, видны светящиеся зеленоватые гранулы. Для подтверждения наличия вируса в мозге ставят биопробу на белых мышах – сосунах или на кроликах [15].

Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша – Негри, ИФ и других.

Лабораторных животных заражают 10%-ой суспензией, приготовленной из патологического материала (вырезанные участки головного мозга). Перед инъекцией суспензию обрабатывают антибиотиками (пеницилином и стрептомицином). В случае отсутствия антибиотиков 10%-ную суспензию готовят на физиологическом растворе, содержащем 0,5% фенола, или на растворе тиомерсана (мертиолята) 1:5000 и оставляют на 6 часов при комнатной температуре или на сутки в холодильнике, после чего используют для заражения.

Для биопробы отбирают кроликов или белых мышей месячного возраста. Белых мышей заражают в головной мозг или подкожно. Место инъекций в мозг находится за линией соединяющей задние углы глаз и немного в бок от линии, проходящей по середине головы. Предварительно этот участок протирают спиртом. Суспензию вводят в объеме 0,03мл. при подкожном заражении материал вводят в область кончика носа в дозе 0,05 мл, на месте введения образуется своебразная «опухоль» [26].

Кроликов заражают в мозг суспензией в дозе 0,2 мл, а внутримышечно в дозе до 2 мл.

После 4-5 дневного инкубационного периода у эараженных животных при наличии вируса в исследуемом материале развивается клиническая картина паралитического бешенства. Животных следует умертвить при помощи эфирного или хлороформенного наркоза.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ДИАГНОЗ.

Дифференциальная диагностика заболевания животных бешенством очень сложная, требует знания признаков заболевания целого ряда сходных заболеваний, наиболее распространенные заболевания, которые встречаются на территории Украины это болезнь Ауески, инфекционный энцефаломиелит, болезнь Тешена, различные формы чумы у собак, свиней, лошадей, крупного рогатого скота, лептоспирозы и листериоз животных, губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота и др. [10,11].

Болезнь Ауески, больные животные неагрессивны, не бывает извращение аппетита, паралича нижней челюсти.

У собак исключают нервную форму чумы, отличающуюся затяжным течением, высокой контагиозностью, возможностью выздоровления больных животных.

Бешенство лошадей сходно по клинической картине с инфекционным энцефаломиелитом. Но есть и отличия: сильная желтушность слизистых оболочек, отсутствие агрессивности, выздоровление некоторых больных.

Подозрение на бешенство может возникнуть при отравлениях, коликах и других незаразных болезнях, для которых характерны сильные боли и беспокойство животных, а также при наличии инородных тел в ротовой полости, глотке, пищеводе, желудках и преджелудках. Однако в таких случаях не развиваются типичные для бешенства параличи.

Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство во всех сомнительных случаях. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов вируса бешенства, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в полимерезной цепной реакции сегмента гена N [22].